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常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍

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资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢 常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签: 分子生物学 细胞生物学 常用实用技术 基本实验室技术 生物学实验 教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用 的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选,酶切图谱的制作,基因序列的定量和定 性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的 条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核 酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的 基因组 DNA 和细胞总 RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记 的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知 DNA 或 RNA 片段。根据其来源和性 质可分为 cDNA 探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA 探针等。 固相杂交 固相杂交(solid-phase hybridization)是将变性的 DNA 固定于固体基质(硝酸纤维素 膜或尼龙滤膜)上,再与探针进行杂交,故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交(dot hybridization) 是道先将被测的 DNA 或 RNA 变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的 DNA 或 RNA 探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永 分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果,可 以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且 特异性较差,有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blotting hybridization) 精品文档 资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢 Southern 印迹杂交:凝胶电离经限制性内切酶消化的 DNA 片段,将凝胶上的 DNA 变 性并在原位将单链 DNA 片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定, 再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应,用放射性自显影或酶反应显色,检 测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量 分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等。 Northern 印迹杂交:由 Southerm 印杂交法演变而来,其被测样品是 RNA。经甲醛或聚 乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上,进行杂交反应,以鉴定基中特定 mRNA 分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程 度。 差异杂交(differential hybridization) 是将基因组文库的重组噬菌体 DNA 转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同 cDNA 探针(如:转移性和非转移性癌组织的 mRNA 逆转录后的 cDNA)分别与滤膜上的 DNA 杂交,分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组 不太复杂的真核生物(如酵母)表达基因的比较,假阳性率较低。但对基因组非常复 杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低(仅 5%左 右),价值不大。 cDNA 微点隈杂交(cDNA microarray hybridization) 是指将 cDNA 克隆或 cDNA 的 PCR 产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上 (如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同 DNA 探针与微点阵上的 DNA 进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信 息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低,适用于大规模的分析。已成商品 问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。 寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotide microarray hybridization) 精品文档 资料收集于网络 如有侵权请联系网站 删除 谢谢 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面,与*均长 度为 20-50nt 的混合 RNA 或 cDNA 探针进行杂交,以提高杂交的特异性和灵敏度。应 用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度 mRNA 的检测,以 区分基因家族不同成员的差异表达特征,或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择 性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。 液相杂交(solution hbridization) 指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链(探针)在溶液中保温, 使之形成杂交复合物。反应结束后,用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交 双链分开,然后结膈后在杂妆分子中的探针量,就可推算出被测的核酸量。 递减杂交(subtractive hybridizatio) 是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取 mRNA(或逆转录成的 cDNA),在一 定的条件下以过量的驱动 mRNA 或 cDNA 与测试的单链 cDNA 或 mRNA 进行液相杂交, 通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之 间相同的基因成分,保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选 cDNA 文库, 可获得特异表达的目的基因 cDNA 全长序列。 核酸原位杂交 用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其 实行检测的方法,称为核酸原位杂交(nucleic acid hybridization in situ)。用来检测 DNA 在细胞核或染色休上的分布,与细胞内 RNA 进行杂交以研究该组织细胞中特定基 因表达水闰;还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。 该法的优点是特异性高,可精确定位;能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而 不受同一组织中其他成分的影响;不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的



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